股骨頭壞死（osteonecrosisofthefemoralhead，ONFH）是以骨的活性成分死亡為主要改變的病理過程【1-5】。該病主要分為創(chuàng)傷性O(shè)NFH和非創(chuàng)傷性O(shè)NFH兩大類，前者主要因髖部外傷引起，而后者的致病因素以激素或酒精最為常見。目前對(duì)于酒精性O(shè)NFH的確切發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。自噬是維持細(xì)胞正常功能的一個(gè)重要機(jī)制，其調(diào)控異?？蓪?dǎo)致各類疾病的發(fā)生【6】。目前已有研究證實(shí)細(xì)胞自噬是軟骨對(duì)自身的一種重要保護(hù)機(jī)制，軟骨細(xì)胞的自噬水平隨著機(jī)體衰老的進(jìn)程而逐漸降低，因而體內(nèi)細(xì)胞自噬水平降低被認(rèn)為是引起關(guān)節(jié)軟骨退變的重要原因之一【7-10】。但在酒精性O(shè)NFH進(jìn)程中是否也存在細(xì)胞自噬水平的改變，以及細(xì)胞自噬是否在ONFH的進(jìn)展過程中也發(fā)揮著重要作用，目前尚無定論。本研究主要探討細(xì)胞自噬在酒精性O(shè)NFH中的作用及其機(jī)制，以期為防治ONFH提供新的思路和依據(jù)。

材料與儀器

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1月齡健康雄性SPF級(jí)C57小鼠15只，體質(zhì)量20～25ｇ，由溫州醫(yī)科大學(xué)茶山動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2016-0006。實(shí)驗(yàn)方案通過醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

２.實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

MC3T3-E1細(xì)胞（浙江美谷生物有限公司），雷帕霉素（美國Sigma公司），CCK8細(xì)胞活性檢測試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白含量測定試劑、SDA－PAGE凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），α－MEM液體培養(yǎng)基［賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司］，蘇木素－伊紅（hematoxylinandeosin，HE）染色試劑盒（北京索來寶公司），哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin,mTOR）抗體、微管相關(guān)蛋白１輕鏈３（microtubule-associatedprotein１lightchain3,LC3）Ｂ抗體、Beclin-1抗體、β－actin抗體（美國CellsignalTechnology公司），ECL發(fā)光液（美國Invitrogen公司），聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride,PVDF）膜、超純水凈化系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

方法

1.動(dòng)物分組、造模和取材

適應(yīng)性喂養(yǎng)１周后將15只1月齡SPF級(jí)C57小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、酒精組、雷帕霉素－酒精組，每組５只。將雷帕霉素溶于酒精中制成濃度為20mg·mL-1溶液，過濾消毒后，重懸（0.25％聚乙二醇，0.25％吐溫８０）成濃度為1mg·mL-1的雷帕霉素溶液。空白對(duì)照組喂食飲用水6周，每天腹腔內(nèi)注射5mg·mL-1不含雷帕霉素的溶劑（酒精過濾消毒后，采用0.25％聚乙二醇、0.25％吐溫80配置的用于溶解雷帕霉素的溶劑），連續(xù)注射2周；酒精組喂食含30％酒精的飲用水６周，每天腹腔內(nèi)注射５mg·mL-1不含雷帕霉素的溶劑，連續(xù)注射2周；雷帕霉素－酒精組喂食含30％酒精的飲用水6周，每天腹腔內(nèi)注射５mg·mL-1的雷帕霉素溶液，連續(xù)注射2周。干預(yù)6周后將小鼠處以安樂死，從其右側(cè)大腿部切開皮膚、皮下組織，剝離股骨周圍肌肉，完整獲取各組小鼠右側(cè)股骨頭，微型CT平掃后將股骨頭用10％甲醛固定、用10％乙二胺四乙酸二鈉溶液脫鈣，石蠟包埋切片。

2.模型鑒定

用微型CT平掃各組小鼠右側(cè)股骨頭，觀察股骨頭組織形態(tài)。將切片置于55℃烤箱30min后浸潤于二甲苯中10min，更換新的二甲苯后再次浸潤10min；用PBS清洗3次，每次５min；用無水乙醇及梯度濃度酒精水化，再次用PBS清洗３次，每次５min；蘇木素染色10min，用清水洗去多余的染色液10min；蒸餾水洗滌10ｓ，１％鹽酸乙醇褪色分化5s，伊紅染色１min左右后用PBS清洗３次，每次５min；再次使用梯度濃度酒精脫水。脫水完成后使用二甲苯透明５min，用中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察股骨頭組織形態(tài)。于高倍鏡下任選５個(gè)視野，每個(gè)視野內(nèi)計(jì)數(shù)50個(gè)骨陷窩，計(jì)算空骨陷窩百分比，以此表示總細(xì)胞凋亡率?？展窍莞C百分比＝空骨陷窩數(shù)／骨陷窩數(shù)×100％。

3.不同濃度酒精干預(yù)下MC3T3-E1細(xì)胞相對(duì)生長率測定

采用CCK8法檢測MC3T3-E1細(xì)胞相對(duì)生長率。在α－MEM培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞至第３代后，將其計(jì)數(shù)稀釋后以每孔5×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)液，加入含酒精濃度為０mmol·L-1（對(duì)照組）、25mmol·L-1、50mmol·L-1、100mmol·L-1、200mmol·L-1的α-MMEM培養(yǎng)基，孵育24h，孵育時(shí)使用封口膜封閉96孔板，防止酒精揮發(fā)。處理完成后，再將10μL的CCK8反應(yīng)液加入到每個(gè)孔中，將96孔板用封口膜封閉后置入37℃的培養(yǎng)箱中再孵育１ｈ。將96孔板從培養(yǎng)箱中取出，用酶標(biāo)儀以450nm波長檢測樣品吸光度值（OD值），計(jì)算MC3T3-E1細(xì)胞相對(duì)生長率。細(xì)胞相對(duì)生長率＝（實(shí)驗(yàn)組OD值－培養(yǎng)基OD值）/（對(duì)照組OD值－培養(yǎng)基OD值）。

4.MC3T3-E1細(xì)胞分組

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)所得出的最佳酒精干預(yù)濃度（100mmol·L-1）及最佳孵育時(shí)間（24ｈ），將培養(yǎng)好的第３代MC3T3-E1細(xì)胞隨機(jī)分為４組，分別以普通α－MEM培養(yǎng)基（正常組）、含100mmol·L-1酒精的α－MEM培養(yǎng)基（含酒精組）、含100mmol·L-1雷帕霉素的α－MEM培養(yǎng)基（含雷帕霉素組）、含100mmol·L-1酒精和100mmol·L-1雷帕霉素的α－MEM培養(yǎng)基（含酒精－雷帕霉素組）培養(yǎng)，均連續(xù)培養(yǎng)24h。

5.MC3T3-E1細(xì)胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、ｍTOR、Beclin-1的蛋白表達(dá)檢測

采用Westernblot法。在每個(gè)面積為16cm2的MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入200μL預(yù)冷的RIPA裂解液，同時(shí)加入１％的蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟。用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞,并用移液槍將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，并反復(fù)吹打混勻后，于預(yù)先準(zhǔn)備好的冰上放置20min。在４℃下離心５min（轉(zhuǎn)速12000r·min-1，離心半徑8cm），取上清液，得到總蛋白。

BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)樣本總蛋白濃度測定的結(jié)果，加入相應(yīng)體積的總蛋白樣品與5倍蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液，輕輕混合，沸水中煮5min使蛋白變性，制備成蛋白樣品，立即插入冰中待用；將樣品輕輕加至凝膠孔中，電泳儀設(shè)置成穩(wěn)壓狀態(tài)，接通電源，將電壓調(diào)至恒壓80V，當(dāng)?shù)鞍字练蛛x膠中時(shí)使用120V恒壓。當(dāng)?shù)鞍讟颖倦娪局聊z的最下端時(shí)結(jié)束電泳。采用半干轉(zhuǎn)的方式將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，其中LC3B抗體使用直徑0.22μｍ的PVDF膜，Beclin-1、mTOR和β-actin使用直徑為0.45μｍ的PVDF膜。

轉(zhuǎn)膜完成后用TBST緩沖液洗滌３次，每次10min，將轉(zhuǎn)移膜置于封閉液中，室溫、搖床上緩慢搖動(dòng)狀態(tài)下封閉１ｈ；將一抗（LC3B、mTOR、Beclin-1）用封閉液稀釋（抗體稀釋度均為1:300，內(nèi)參β－avtin抗體稀釋度為1：1000）。將封閉后的膜直接放入一抗工作液中，注意反應(yīng)面必須被一抗工作液完全覆蓋，４℃下?lián)u床反應(yīng)過夜。洗凈一抗后放入二抗工作液（稀釋度為1∶3000）中，室溫、避光下在搖床中緩慢搖晃60min，用TBST洗去游離二抗。ECL試劑的Ａ液、Ｂ液等體積混合，制成顯影反應(yīng)液，滴加液體至PVDF膜上直至覆蓋整張膜，避光反應(yīng)2min后曝光拍照。應(yīng)用ImageLab圖像處理軟件分析目的蛋白和內(nèi)參β－actin條帶灰度值，計(jì)算機(jī)自動(dòng)讀取并記錄每條條帶的灰度值。

２．６數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)

據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，不同濃度酒精干預(yù)后MC3T3-E1細(xì)胞相對(duì)生長率的比較及４組小鼠MC3T3-E1細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值及ｍTOR、Beclin-1蛋白表達(dá)的組間整體比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

結(jié)果

1.股骨頭組織形態(tài)

①CT掃描結(jié)果：空白對(duì)照組小鼠股骨頭骨小梁大體形態(tài)良好，分布均勻，未見軟骨下壞死帶形成［圖１(1)］；酒精組小鼠股骨頭軟骨下壞死帶形成，骨小梁閉塞，髓腔內(nèi)骨小梁變細(xì)、稀疏、斷裂，骨皮質(zhì)增厚［圖１(2)］；雷帕霉素－酒精組小鼠股骨頭CT影像學(xué)表現(xiàn)介于酒精組與空白對(duì)照組之間，可見髓腔內(nèi)部分骨小梁出現(xiàn)斷裂萎縮，軟骨下骨部分壞死形成［圖１(3)］。

②顯微鏡下觀察結(jié)果：空白對(duì)照組小鼠股骨頭骨小梁形態(tài)良好，未見空骨陷窩、脂肪細(xì)胞及脂質(zhì)沉積，無組織壞死、纖維化［圖２(1)］；酒精組小鼠股骨頭骨小梁稀疏、紊亂，脂肪細(xì)胞增多，骨細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，可見大量空骨陷窩形成，局部組織壞死、纖維化，細(xì)胞數(shù)目減少［圖２(2)］；雷帕霉素－酒精組小鼠股骨頭部分骨小梁出現(xiàn)斷裂、萎縮，可見少量空骨陷窩形成［圖２(3)］。

2.總細(xì)胞凋亡率

空白對(duì)照組總細(xì)胞凋亡率為（6.06±1.93）％，酒精組為（63.9±9.63）％，雷帕霉素－酒精組為（34.0±5.82）％；３組總細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｆ＝192.800，Ｐ＝0.000）；進(jìn)一步兩兩比較，酒精組和雷帕霉素－酒精組總細(xì)胞凋亡率均大于空白對(duì)照組（Ｐ＝0.000，Ｐ＝0.000），酒精組總細(xì)胞凋亡率大于雷帕霉素－酒精組（Ｐ＝0.000）。

3.不同濃度酒精干預(yù)后MC3T3-E1細(xì)胞相對(duì)生長率

不同濃度酒精干預(yù)２４ｈ后MC3T3-E1細(xì)胞相對(duì)生長率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｆ＝106.900，Ｐ＝0.001）。未經(jīng)酒精干預(yù)的MC3T3-E1細(xì)胞相對(duì)生長率高于濃度為25mmol·Ｌ-1、50mmol·Ｌ-1、100mmol·Ｌ-1、200mmol·Ｌ-1的酒精干預(yù)后的MC3T3-E1細(xì)胞相對(duì)生長率（Ｐ＝0.011，Ｐ＝0.000，Ｐ＝0.000，Ｐ＝0.000）。見表１、。

４.MC3T3-E1細(xì)胞中LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ的比值及mTOR、Beclin-1蛋白表達(dá)

４組小鼠MC3T3-E1細(xì)胞中LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ的比值比較，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；正常組MC3T3-E1細(xì)胞中LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ的比值高于含酒精組（Ｐ＝0.000），低于含雷帕霉素組（Ｐ＝0.000），與含酒精－雷帕霉素組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＝0.166）；含酒精組MC3T3-E1細(xì)胞中LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ的比值低于含雷帕霉素組及含酒精－雷帕霉素組（Ｐ＝0.000，Ｐ＝0.000）；含雷帕霉素組LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ的比值高于含酒精－雷帕霉素組（Ｐ＝0.000）。

４組小鼠MC3T3-E1細(xì)胞中ｍTOR蛋白表達(dá)量比較，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；正常組MC3T3-E1細(xì)胞中ｍTOR蛋白表達(dá)量低于酒精組（Ｐ＝0.033），高于含雷帕霉素組及含酒精－雷帕霉素組（Ｐ＝0.000，Ｐ＝0.000）；含酒精組MC3T3-E1細(xì)胞中ｍＴＯＲ蛋白表達(dá)量高于含雷帕霉素組及含酒精－雷帕霉素組（Ｐ＝0.000，Ｐ＝0.000），含雷帕霉素組ｍTOR蛋白表達(dá)量低于含酒精－雷帕霉素組（Ｐ＝0.000）。

４組小鼠MC3T3-E1細(xì)胞中Beclin-1蛋白表達(dá)量比較，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；正常組MC3T3-E1細(xì)胞中Beclin-1蛋白表達(dá)量高于含酒精組，而與含雷帕霉素組、含酒精－雷帕霉素組比較，組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＝0.077，Ｐ＝0.127）；含酒精組MC3T3-E1細(xì)胞中Beclin-1蛋白表達(dá)量低于含雷帕霉素組及含酒精－雷帕霉素組（Ｐ＝0.000，Ｐ＝0.000）；含雷帕霉素組MC3T3-E1細(xì)胞中Beclin-1蛋白表達(dá)量高于含酒精－雷帕霉素組（Ｐ＝0.004）。見圖４至圖６、表２。

LC3：微管相關(guān)蛋白１輕鏈３；mTOR：哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白

LC3：微管相關(guān)蛋白１輕鏈３

mTOR：哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白

LC3：微管相關(guān)蛋白１輕鏈３；mTOR：哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白

討論

ONFH屬中醫(yī)學(xué)“骨痹”“骨痿”“骨蝕”“歷節(jié)風(fēng)”“髖骨痹”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為該病由風(fēng)、寒、濕、熱等外邪侵襲人體，痹阻經(jīng)絡(luò)，氣血運(yùn)行不暢所致【3】。有研究認(rèn)為，ONFH的發(fā)病本質(zhì)在于股骨頭血供中斷或受損，導(dǎo)致骨細(xì)胞凋亡【11】。目前對(duì)于酒精性O(shè)NFH的發(fā)病機(jī)理存在諸多學(xué)說，如骨質(zhì)疏松、骨內(nèi)高壓、血管內(nèi)凝血、骨細(xì)胞毒素作用、骨細(xì)胞凋亡、脂肪代謝紊亂等學(xué)說【1-5】，但其確切發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚?，F(xiàn)已有研究證實(shí)，細(xì)胞自噬是軟骨自身的一種重要保護(hù)機(jī)制，而自噬降低被認(rèn)為是引起關(guān)節(jié)軟骨退變的重要原因之一【7-10】。Zhang等【12】研究發(fā)現(xiàn)，在低氧及無血清的情況下間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過提高自噬水平來促進(jìn)自身存活。另外，Xia等【13】通過體外骨細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，在激素引起骨細(xì)胞變性、凋亡的過程中，自噬也起到了非常重要的保護(hù)作用，抑制自噬后骨細(xì)胞的死亡數(shù)明顯增加。因而我們推測細(xì)胞自噬在酒精性O(shè)NFH的病變過程中也可能發(fā)揮著非常重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)采用濃度為30％的酒精喂食小鼠，構(gòu)建酒精性O(shè)NFH模型。模型建立后將獲取的股骨頭組織用HE染色，在顯微鏡下觀察股骨頭組織形態(tài)，結(jié)果顯示，在酒精干預(yù)下，酒精組小鼠股骨頭中脂肪細(xì)胞增多、骨細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，股骨頭骨小梁稀疏、紊亂，空骨陷窩計(jì)數(shù)增多，且多于空白對(duì)照組及酒精與雷帕霉素組；從微型CT檢查結(jié)果看，單純酒精飼喂后構(gòu)建的小鼠酒精性O(shè)NFH模型中，股骨頭軟骨下壞死帶形成，骨小梁閉塞，髓腔內(nèi)骨小梁變細(xì)、稀疏、斷裂，出現(xiàn)骨皮質(zhì)增厚的現(xiàn)象，但是腹腔內(nèi)注射雷帕霉素后，股骨頭大體形態(tài)良好，部分骨小梁出現(xiàn)斷裂、萎縮，軟骨下壞死帶明顯少于單純酒精喂食的小鼠。

在體外實(shí)驗(yàn)中，我們通過Westernblot法檢測自噬相關(guān)蛋白mTOR、Ｂｅｃｌｉｎ１和ＬＣ３在MC3T3-E1細(xì)胞中的表達(dá)量，結(jié)果顯示含酒精組MC3T3-E1細(xì)胞中LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ的比值及Beclin1蛋白含量較其他組均顯著降低，而mTOR蛋白表達(dá)量較其他組明顯升高；含酒精－雷帕霉素組MC3T3-E1細(xì)胞中mTOR蛋白表達(dá)量低于含酒精組。由此可見，單純酒精刺激可以引起細(xì)胞自噬水平的降低，而雷帕霉素可以與酒精抑制自噬的作用相拮抗。

LC3是公認(rèn)的細(xì)胞自噬標(biāo)志物，自噬形成時(shí)，胞漿型LC3（即LC3-Ⅰ）會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即LC3-Ⅱ），LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低。mTOR復(fù)合體和Beclin1復(fù)合體是調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的關(guān)鍵分子，它們?cè)谧允傻陌l(fā)生過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用【14-15】。

目前普遍認(rèn)為mTOR通過兩種機(jī)制發(fā)揮對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用：

①mTOR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用于下游效應(yīng)物，如轉(zhuǎn)錄起始因子４E結(jié)合蛋白１、核糖體蛋白S6激酶，啟動(dòng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而控制細(xì)胞自噬；

②mTOR激酶直接作用于Atg蛋白來調(diào)節(jié)自噬體的形成【16-17】。當(dāng)mTOR活性受到抑制時(shí)促使細(xì)胞自噬發(fā)生，當(dāng)mTOR活性增高時(shí)自噬被抑制。Beclin1又稱BECN1，它是酵母自噬相關(guān)基因ATG6的同系物，也是哺乳動(dòng)物參與細(xì)胞自噬的特異性基因，Beclin1基因主要通過與Ⅲ型磷酯酰肌醇３激酶形成復(fù)合體來調(diào)節(jié)其他ATG蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中定位，調(diào)節(jié)自噬活性【18-19】。有研究已證實(shí)，通過上調(diào)Beclin1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)能夠刺激自噬的發(fā)生，敲除該基因細(xì)胞自噬則不能發(fā)生【14、17】。

本研究使用的雷帕霉素是經(jīng)典的細(xì)胞自噬增強(qiáng)劑，自噬的調(diào)控途徑主要涉及經(jīng)典的磷酯酰肌醇３激酶／蛋白激酶Ｂ／雷帕霉素靶蛋白信號(hào)途徑。而雷帕霉素通過抑制mTOR，誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞自噬過程，許多因素對(duì)自噬的影響均與mTOR的活性變化有關(guān)［２０－２１］。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)用雷帕霉素增強(qiáng)細(xì)胞自噬水平后，細(xì)胞的凋亡水平以及細(xì)胞生長抑制率明顯降低，這說明細(xì)胞自噬能夠一定程度上抑制酒精刺激下的MC3T3-E1細(xì)胞的死亡，細(xì)胞自噬對(duì)成骨細(xì)胞（MC3T3-E1）起著一定的保護(hù)作用，這將為治療酒精性O(shè)NFH提供新的思路。

本研究結(jié)果顯示，細(xì)胞自噬在酒精性O(shè)NFH的病變過程中發(fā)揮著非常重要的保護(hù)作用。酒精刺激引起的細(xì)胞自噬水平的降低可能是引起ONFH的原因之一，其作用機(jī)制可能與酒精刺激影響自噬關(guān)鍵調(diào)控分子mTOR、Beclin1的表達(dá)有關(guān)。今后，提高細(xì)胞自噬水平可作為預(yù)防或治療酒精性O(shè)NFH的重要靶點(diǎn)。