葡萄糖是腦組織最主要的能量來源，它通過葡萄糖轉運蛋白(GluT)介導的易化擴散透過細胞膜。腦內(nèi)主要有兩種GluT，即Glu1和GluT_3，位于腦血管內(nèi)皮細胞、星型膠質細胞和神經(jīng)元[1]。血糖濃度、缺氧缺血等均影響GluT基因表達和相應蛋白質合成。本實驗觀察糖尿病(對大鼠腦內(nèi)GluT表達的影響。

　　主要儀器和試劑：激光共聚焦顯微鏡(Radiance2100Bio-Rad)、圖像分析儀(Lasersharp2000)，恒冷切片機(CM1900Lei—ca)，血糖儀(羅氏公司)，STZ(Sigma批號：105k1668)，

　　實驗動物及分組：清潔級健康雄性Wistar大鼠(魯抗醫(yī)藥實驗動物中心)30只，體重210～220g。隨機分為正常(NC)組1O只；造模組20只(喂高脂飼料)。4周后尾靜脈注射STZ40mg／kg，72小時后隨機血糖>13mmol／L者確定為DM成模，取1O只為DM組。

　　標本制備：大鼠成模4周后，冰PBS心臟灌注，斷頭取腦，置于4多聚甲醛固定6小時，移至30蔗糖溶液內(nèi)，4℃冰箱內(nèi)待腦組織下沉，取出后OCT包埋，置一80℃冰箱內(nèi)待用。

　　GluT的免疫熒光染色：冠狀位全腦組織連續(xù)冰凍切片，厚8肚m，連續(xù)選擇相當于視交叉后3mm水平[5位置的腦組織，GluT-1、GluT-3各3張，H02與純甲醇浸泡腦片，水洗后滴加BSA封閉液，室溫2O分鐘，甩去液體不洗。0．1TritonX100-PBS浸泡2～3分鐘，碘化丙啶(PI)浸泡2O分鐘，PBS洗后滴加1：300的一抗(兔IgG)，37~C孵育1小時。漂洗后滴加二抗(FITc標記羊抗兔抗體)37℃孵育2O分鐘。PBS反復漂洗后，甘油一PBS封片，無色指甲油封固，避光、低溫保存待檢。陰性對照用PBS代替一抗。

　　GluT檢測：美國伯樂Radiance2100型激光掃描共聚焦顯微鏡的氬離子激光系統(tǒng)，同時掃描FITC和PI標記的陽性反應物。掃描參數(shù)：激發(fā)光波長488nm，觀測光波長518和576nm，物鏡為20倍(Glu1)，由于GluT-3散在分布，物鏡為40倍點掃描，Zoom為1．0。經(jīng)Lasersharp2000軟件攝像、分析大鼠大腦海馬各區(qū)以及皮質部位GluT_1和GluT-3的表達情況。每張切片海馬和皮質各觀察1O個視野。計算各視野綠色熒光陽性面積的百分率，以平均陽性率分析各組不同腦區(qū)內(nèi)GIuT的表達。

　　統(tǒng)計學方法：數(shù)據(jù)以i±S表示，用SPSS12．0軟件包分析，用t檢驗進行均數(shù)兩兩比較，檢驗標準a=0．05。

　　NC組海馬部位GluT一1和GluT一3的表達多于皮質部位。DM組皮質及海馬部位GluT一1表達均減少，GluT一3海馬部位表達增加(P均<O．01)，皮質部位無明顯變化(P>O．05)。表l大鼠腦內(nèi)GluT一1和GluT-3的平均陽性率。

　　腦內(nèi)毛細血管的密度是決定GluT_1密度的主要因素；GluT-3是神經(jīng)元特異的GluT，負責在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)將葡萄糖轉運給神經(jīng)元。GluT_3mRNA及其蛋白質在腦內(nèi)廣泛分布，GluT-3的表達和活性對極其脆弱的神經(jīng)元損傷后能否存活起決定作用。

　　本實驗發(fā)現(xiàn)：正常組大鼠海馬部位GluT-1和GluT一3表達多于皮質部位。糖尿病組大鼠腦內(nèi)GluT一1表達減少，海馬部位GluT一3表達有所增加，皮質部位無明顯變化，與相關報道結論大體一致。糖尿病患者后腦內(nèi)GluT一1和GluT一3表達變化可能是機體適應糖尿病狀態(tài)下腦能量代謝的代償機制。GIuT—I的變化可能與轉錄穩(wěn)定性的變化有關，GluT一1mRNA衰減在控制轉錄后基因表達的調(diào)控中起重要作用。糖尿病有可能通過引起GluT一1tuRNA轉錄穩(wěn)定性降低，進而引起GluT一1表達減少。GluT一3表達增加則可能是由于GluT一1表達減少引起腦內(nèi)葡萄糖供應量減少，需求量增加，GluT一3代償性半衰期延長而增加?？梢奊luT的表達、調(diào)節(jié)、活性對神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)起著重要作用。

（實習編輯：黃俊達）