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乙型肝炎病毒cccDNA：檢測指標還是治療靶標？

摘要：作為治療藥物，無論分子量大小，進入核內并有效發(fā)揮作用的可能性還很難預測。有人設想通過三鏈DNA技術，直接“靜默”cccDNA分子，迄今沒有獲得預期的研究結果。

 　　乙型肝炎病毒（HBV）共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）是HBV復制的初始模板。其在肝細胞核內持續(xù)、穩(wěn)定地存在，故被認為是HBV感染慢性化及抗HBV治療停止后肝炎復發(fā)最主要的原因。近年來，隨著以選擇性實時熒光PCR技術為代表的各類cccDNA檢測技術日漸成熟，以及臨床醫(yī)生對cccDNA檢測臨床意義的認識不斷提高，cccDNA檢測已從基礎研究逐漸進入到臨床應用。然而，慢性乙型肝炎抗病毒治療不能達到徹底清除病毒的目的，皆因肝細胞核內乙肝病毒復制模版cccDNA不能被徹底清除，成為停藥后復發(fā)，甚至耐藥變異的根源，因此，只有清除肝細胞核內HBV cccDNA，才有實現(xiàn)治愈慢性乙型肝炎的目的。 

　　一、HBV cccDNA分子結構特性及其意義
 
　　嗜肝DNA病毒基因組是一種松弛環(huán)狀的雙鏈DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）分子，其兩條鏈均不是閉合的，其中負鏈較長，含有病毒基因組的全長基因，在其5ˊ起始端與3ˊ末端之間有一個數(shù)個堿基的“缺刻”(nick)；正鏈較短，有較大的“缺口” (gap)，其3ˊ末端不固定，故長度是可變的，約為負鏈長度的50%～100%。在病毒的復制過程中，病毒DNA進入宿主細胞核，兩條鏈的缺口均被補齊，形成超螺旋的共價、閉合、環(huán)狀DNA分子（covalently closed circular DNA，cccDNA）。目前，無論是從分子機制研究乙肝病毒，還是從臨床抗病毒角度觀察療效，建立的多種HBV cccDNA檢測技術，均是利用了上述rcDNA與cccDNA在結構上的差異，從而可以在抽提肝組織或血清核酸時、在設計PCR引物時、在鑒定產物特異性時，可以有效地區(qū)分兩種不同乙肝病毒基因。
 
　　cccDNA是嗜肝DNA病毒在肝內進行復制的原始模板，雖然其含量較少，但對病毒在宿主細胞內感染狀態(tài)的建立以及維持病毒在細胞內的復制過程具有十分重要的意義。與rcDNA不同，cccDNA位于宿主肝細胞的細胞核而非細胞漿中。
 
　　病毒進入被感染細胞后，脫去外殼蛋白并釋放出基因組DNA，即rcDNA，隨后rcDNA進入宿主細胞核中轉變成cccDNA分子，此即為cccDNA的“從頭合成”(de novo synthesis)。rcDNA轉變?yōu)閏ccDNA依賴的酶是宿主細胞內的酶而非病毒的DNA聚合酶。這是非常重要的提示，可以設想，任何試圖阻止“從頭合成”的干預手段，都必然會干擾細胞內業(yè)已存在的、維護細胞正常功能的酶。如果試圖從cccDNA這個“源頭”清除乙肝病毒，必須顧及宿主細胞的正常生理過程不受干擾。另外，從rcDNA變成cccDNA的過程，不只是兩條鏈結構完整性的改變，還包括空間結構的改變，即超螺旋結構的形成，超螺旋結構的形成，需要具有解旋、拓撲異構等生物學活性的酶的參與，而這兩種功能顯然是病毒DNA聚合酶所不具備的，同樣需要有宿主細胞“提供”，換言之，試圖通過干擾這些酶的活性來清除cccDNA也要面臨肝細胞自身功能被干擾的問題。
 
　　在合成子代病毒DNA的過程中形成第二鏈（正鏈）時，如果RNA引物不從DR1轉位到DR2，而是從DR1位置開始引發(fā)原位引發(fā)（in-situ priming），形成的產物將不再是松弛環(huán)狀的病毒基因組，而是雙鏈線性DNA病毒基因組（dsl-DNA），dsl-DNA分子可以通過非同源重組的方式合成cccDNA分子，并仍能正常轉錄產生前基因組RNA，并再次通過非同源重組轉化成新的cccDNA分子，但每次新形成的cccDNA分子在序列上都不同于母代cccDNA分子。嗜肝DNA病毒的這種方式又被稱為非法復制（illegitimate replication）。與cccDNA從頭合成方式相比，“非法復制”的發(fā)生率雖然較低，但它的影響可能并不弱，因為這也可能是病毒除點突變之外的逃避宿主免疫乃至藥物選擇壓力的一種“異常”的變異方式。眾所周知，乙肝病毒基因組在復制過程中，由于缺乏自身校對功能，因此，與選擇壓力無關的復制變異的不斷積累，即導致感染者體內有大量復雜的基因組準種存在，以及多種基因型的存在。然而，這種非法復制，則可能是準種復雜和病毒變異度高的更為重要和復雜的因素。這對解決臨床耐藥問題有重要意義。
 
　　二、cccDNA作為檢測與監(jiān)測指標的可能性及意義
 
　　檢測cccDNA的技術問題已經沒有太大難度。國內較多研究者開展檢測技術研究，發(fā)表了較多相關論文，少數(shù)臨床檢測試劑商甚至已經開發(fā)了cccDNA的檢測試劑盒。本研究小組在國內較早開展cccDNA檢測技術研究，十余年中積累了較多經驗。本文討論與檢測相關的一些有爭議的問題。
 
　　1.關于肝活檢組織檢測cccDNA。乙肝病毒基因組較小，僅3.2kb，以cccDNA的形式主要存在于肝細胞內，外周血單個核細胞中是否存在cccDNA一直有爭議。而在肝細胞漿、血清（漿）、組織液，甚至其他組織器官中乙肝病毒基因組是以rcDNA的形式存在的，臨床上乙肝病毒基因常規(guī)PCR定量或定性檢測技術，均是以rcDNA為模板。若要檢測cccDNA，則必須以肝組織為標本。肝臟活檢是有創(chuàng)技術，有一定風險，并發(fā)癥不可避免，技術要求也較高。在我國，某些城市和地區(qū)的某些較高級別的醫(yī)院，可常規(guī)開展肝穿刺活檢技術，而在絕大多數(shù)醫(yī)院并非常規(guī)。另外，一次穿刺很難獲得大量標本，所獲得的肝組織標本的直徑或長度均受到限制。標本既要做常規(guī)病理觀察，還可能要做免疫組化，若再用于檢測cccDNA標本量顯然不足。因此，以肝組織為標本檢測cccDNA的難度較大。
 
　　2.關于PBMCs作為替代檢測標本。PBMCs常常作為某些病原分子或免疫分子檢驗或檢測的“替代”標本，其取材的便利度介于血清和肝組織之間。然而，如前所述PBMCs中是否存在HBV cccDNA尚無定論，我們的前期研究未能在PBMCs檢出cccDNA，因此，如果試圖以PBMCs為標本來檢測cccDNA是有很大“風險”的，現(xiàn)階段也是不可能常規(guī)化的。
 
　　3.關于嚴重肝病患者血清中是否出現(xiàn)cccDNA。乙肝病毒感染者病情的差異很大，從疾病階段上講，包括了攜帶者、慢乙肝活動期、肝硬化代償期或失代償期、肝癌；從疾病嚴重程度上講，可表現(xiàn)為輕、中、重，以及重型肝炎，那么這些差異是否可以通過檢測cccDNA來甄別？我們曾經推測，在慢乙肝重度向重型肝炎發(fā)展的某個特定的階段，由于大量肝細胞壞死，細胞核內cccDNA可能會大量釋放入血，此時有可能從血清中被檢出，并以此作為判定乙型肝炎重癥化的可靠指標。然而，該研究未能獲得預期的結果：未能在重癥肝炎前期或重癥肝炎患者的血清中檢出cccDNA。
 
　　4.關于cccDNA與核苷類藥物耐藥變異。我們采用選擇性熒光PCR及產物直接測序法，對40例慢性HBV感染者行肝移植前的肝組織內cccDNA耐藥變異情況進行了檢測，結果共在4例使用過拉米夫定的患者肝組織檢測到cccDNA耐藥變異。其中2例患者cccDNA發(fā)生rtM204I變異，且肝內rcDNA和血清HBV DNA亦發(fā)生相應的變異。另有1例患者肝內cccDNA、rcDNA存在rtM204I變異，1例肝內cccDNA、rcDNA存在rtQ215H變異，但二者血清HBV DNA卻未檢測到相應變異。另外，我們還在85例未經抗病毒治療的慢性HBV感染者中，發(fā)現(xiàn)2例患者存在cccDNA 自然變異。其中1例為rtM204I變異，另1例為rtV214A變異，且肝組織內rcDNA與血清HBV DNA中也存在相同的變異。我們進一步對上述檢出cccDNA自然變異患者的肝組織cccDNA和rcDNA、血清HBV DNA標本進行PCR克隆測序分析， 結果顯示，肝內cccDNA耐藥相關位點自然變異實際上為變異株與野生株混合存在，但以變異株為優(yōu)勢株，但肝內cccDNA、rcDNA及血清HBV DNA的變異株和野生株比例并不一致。
 
　　5.關于cccDNA清除與抗病毒治療終點。目前被普遍認同的觀點是：任何抗病毒治療措施，即使最終發(fā)生了HBsAg血清轉換，病毒依然在肝內復制，只有完全清除了肝細胞核內的cccDNA才能實現(xiàn)徹底治愈，因為cccDNA是乙肝病毒復制的原始模板。
 
　　現(xiàn)有的抗病毒藥物對肝細胞內cccDNA的影響較為有限。有作者分別研究了聚乙二醇干擾素+阿德福韋酯、拉米夫定或聚乙二醇干擾素+拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋等對慢乙肝患者肝細胞內cccDNA的影響，結果顯示這些藥物在有限療程內均不能清除cccDNA。盡管如此，抗HBV治療后肝組織內cccDNA的含量可以作為慢乙肝患者獲得持久病毒學應答（sustained virological response， SVR）的重要預測指標。有限研究揭示了一點，即通過長期抑制體內乙肝病毒復制，使得肝細胞核中形成cccDNA的原料逐步減少，新的cccDNA分子得不到進一步補充，而老一代cccDNA分子也逐漸衰減。因此，長期抗病毒治療（尤其是采用核苷類藥物抗病毒）的最終結果就是逐漸耗竭肝細胞內cccDNA，這對于減少停藥后肝炎復發(fā)有意義?？共《局委熀缶烤剐瓒嚅L時間能耗竭cccDNA，目前尚缺乏有說服力的研究證據(jù)。有學者根據(jù)阿德福韋酯治療慢乙肝患者1年后細胞內cccDNA含量的變化，推算出完全清除細胞內cccDNA大約需要14.5年。然而，該結論的依據(jù)并非來自可靠的數(shù)學模型。
 
　　6.關于HBsAg含量監(jiān)測作為cccDNA清除指標。近年來HBsAg定量檢測技術發(fā)展很快，技術本身已經成熟，臨床應用也很廣泛，尤其是用于預測抗乙肝病毒的療效，引起學術界的廣泛重視。但是HBsAg含量的動態(tài)變化是否與cccDNA的清除呈正相關的關系一直是爭議焦點。筆者認為，從以下三點可以否定這種關系：第一，HBV DNA陰性，且HBeAg陰性的HBV感染者體內一直維持較高水平HBsAg；第二，HBsAg含量變化與療效一致性非常有限，因此，其定量價值被夸大；第三，從分子機制和乙肝病毒基因組循環(huán)機制看，HBsAg與cccDNA之間的直接或間接的量效關系是非常牽強的。故筆者不建議把HBsAg定量觀察作為cccDNA是否被清除的替代指標。
 
　　三、cccDNA作為抗病毒治療靶標的意義及其可能性
 
　　可獲取的有關cccDNA作為抗病毒治療靶標的研究資料非常有限。從乙肝病毒吸附于肝細胞膜到進入肝細胞漿，并釋放出乙肝病毒rcDNA，到穿過核膜并形成cccDNA，再以cccDNA為原始模板轉錄為前基因組RNA（pgRNA），到再合成新的DNA分子，并在胞漿內包裝成完整的乙肝病毒顆粒、釋放入血，再感染其他肝細胞，上述過程是一個完整和連續(xù)的循環(huán)。據(jù)此可以推測，任何消滅肝外病毒、阻止病毒入胞或出胞，甚至干擾細胞核內轉錄過程的治療設計思路，均是以rcDNA為靶標，注定不可能“根治”慢性乙型肝炎，除非等待漫長的“耗竭”。如果能阻止rcDNA進入肝細胞核，或者進入核內直接分解cccDNA分子，才能真正從源頭清除乙肝病毒。從這種意義上講，cccDNA是抗病毒治療的最理想靶標。問題在于其可行性。
 
　　面臨的困難之一：從rcDNA轉變成cccDNA依賴細胞內的酶而不是病毒DNA聚合酶！這些酶包括外切核酸酶、DNA合成酶、拓撲異構酶等，換言之，若以cccDNA為靶標，就要以上述酶為靶標。很顯然抑制或消除這些酶的活性不僅目前沒有技術可能性，而且其“傷及無辜”的后果尚無法預測。
 
　　面臨的困難之二：作為治療藥物，無論分子量大小，進入核內并有效發(fā)揮作用的可能性還很難預測。有人設想通過三鏈DNA技術，直接“靜默”cccDNA分子，迄今沒有獲得預期的研究結果。
 
　　面臨的困難之三：以干擾素為代表的、可能實現(xiàn)治愈乙肝的抗病毒藥物，無論是免疫調節(jié)還是獨立的抗病毒作用機制，其結果均是以犧牲感染了乙肝病毒的肝細胞為代價，因此，接受治療者，肝臟代償功能必須良好，肝臟潛在的修復能力必須強大，否則易發(fā)肝衰竭；另外，干擾素發(fā)揮作用還需要感染者機體免疫功能的配合，否則不能有效殺傷或清除被感染的肝細胞，這也是干擾素長期療效停滯在30%左右的原因。
 
　　綜上，乙型肝炎病毒cccDNA，無論是作為檢驗或監(jiān)測指標，或者是作為根治慢性乙型肝炎的靶標，在理論、技術和實際操作方面都存在諸多未決的問題，難點和“疑點”也很多，需要加強研究。
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