近日，李蘭娟院士在浙大一院慶祝感染科成立60周年大型肝病講座和義診中表示：“再過十幾年的時間，我們要讓中國摘掉‘乙肝大國’的帽子。”事實(shí)上，為了能夠徹底治愈乙肝，很多科研人員都在從事這方面的研究。近期，風(fēng)靡科學(xué)界的基因編輯神器CRISPR也在該領(lǐng)域發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

　　Scientific Reports（9月3日）

　　9月3日，在Nature子刊《Scientific Reports》上發(fā)表的一篇論文中，研究人員在HBV基因組的S和X區(qū)中確定了交叉基因型保守的HBV序列，可被Cas9切口酶靶定進(jìn)行特異性和有效的切割。這種方法不僅能破壞細(xì)胞系中的游離cccDNA和染色體整合HBV靶位點(diǎn)，而且也能破壞慢性感染和新感染肝癌細(xì)胞株中的HBV復(fù)制。這些數(shù)據(jù)表明，可以使用CRISPR/Cas9切口酶，作為HBV感染的新型治療策略。

　　在這項(xiàng)研究中，研究人員調(diào)查了改進(jìn)的CRISPR/Cas9切口酶系統(tǒng)，可選擇性地靶定和滅活記者細(xì)胞系和慢性感染的肝癌細(xì)胞株中的游離以及染色體整合的HBV序列。研究人員證明，HBV的S和X基因的兩個高度保守區(qū)域，可以用于Cas9n介導(dǎo)的HBV滅活，從而支持一個概念：設(shè)計(jì)酶的進(jìn)一步臨床開發(fā)，最終可能根除感染患者體內(nèi)的HBV。[文獻(xiàn)]

　　World J Gastroenterol（8月28日）

　　8月28日，發(fā)表在《World J Gastroenterol》雜志上的一篇論文中，研究人員用雙gRNAs導(dǎo)向CRISPR/Cas9系統(tǒng)抑制了乙型肝炎病毒復(fù)制。論文的通訊作者是北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部病原生物學(xué)系魯鳳民（Feng-Min Lu）教授，其主要從事病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室診斷、HBV感染相關(guān)肝癌發(fā)病機(jī)制等研究。

　　在這篇文章中，研究人員評估了CRISPR/Cas9系統(tǒng)清除HBV A-D基因型的基因組的潛力。他們總共設(shè)計(jì)出了對抗HBV A-D基因型的15種gRNAs。選出了覆蓋HBV調(diào)控區(qū)域的11個雙gRNAs組合。通過測量HBV表面抗原(HBsAg)或培養(yǎng)物上清液中的E抗原(HBeAg)檢測了每種gRNA和11個雙gRNAs抑制HBV（A-D基因型）復(fù)制的效力。利用PCR和測序方法檢測了在共轉(zhuǎn)染雙gRNAs和HBV表達(dá)載體的HuH7細(xì)胞中HBV表達(dá)載體的破壞情況。并利用KCl沉淀、PSAD消化、滾環(huán)擴(kuò)增結(jié)合定量PCR的方法在HepAD38細(xì)胞中檢測了cccDNA的破壞情況。并評估了這些gRNAs的細(xì)胞毒性。

　　結(jié)果顯示所有g(shù)RNAs都可以顯著減少培養(yǎng)物上清液中HBsAg或HBeAg生成，這取決于gRNA對抗的區(qū)域。所有的雙gRNAs都可以有效的抑制HBV A-D基因型生成HBsAg和/或HBeAg，與單gRNA相比，雙gRNAs抑制HBsAg和/或HBeAg生成的效力大大提高。此外，通過PCR直接測序技術(shù)，他們證實(shí)了這些雙gRNAs可通過除去兩gRNAs切割位點(diǎn)之間的片段來破壞HBV表達(dá)模板。更重要的是，gRNA-5和gRNA-12組合不僅可以有效抑制HBsAg和/或HBeAg生成，還能夠破壞HepAD38細(xì)胞中的cccDNA儲存庫。

　　這些結(jié)果表明了，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以有效破壞HBV表達(dá)模板，且沒有明顯的細(xì)胞毒性。它有可能是在慢性HBV感染患者中根除持續(xù)存在的HBV cccDNA的一種潛在的方法。[文獻(xiàn)]

　　Scientific Reports（6月2日）

　　6月2日，發(fā)表在《Scientific Reports》雜志上的一項(xiàng)新研究中，麻省理工學(xué)院的研究人員利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，對受到感染的哺乳動物肝細(xì)胞進(jìn)行基因組編輯，從中刪除了乙肝病毒(HBV)DNA。該研究小組靶向切割了HBV病毒共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)的一些特異位點(diǎn)。

　　研究人員設(shè)計(jì)了24條單鏈向?qū)NAs (sgRNAs)來靶向從在線病毒序列信息資源庫中鑒別出的一些HBV基因組位點(diǎn)。經(jīng)過初篩測試后，研究小組將三個最有效的sgRNAs和Cas9蛋白插入到慢病毒載體中，然后將它們轉(zhuǎn)導(dǎo)到了整合HBV的人類肝細(xì)胞內(nèi)。

　　論文的主要作者之一Vyas Ramanan說：“對包含整合基因組病毒DNA的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系展開實(shí)驗(yàn)，我們看到HBV總DNA和cccDNA逐漸減少，在36天時cccDNA下降了92%。”研究小組還觀察到病毒基因表達(dá)和復(fù)制均顯著減少。[詳細(xì)]

　　Gene Therapy（2月5日）

　　2月5日，來自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)院研究所、第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院、日本京都大學(xué)和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院等處的研究人員，在Nature旗下子刊《Gene Therapy》發(fā)表一項(xiàng)最新研究成果。 在這項(xiàng)研究中，研究人員探討了靶定HBV抗原（HBsAg）編碼區(qū)的CRISPR/CRISPR相關(guān)Cas9系統(tǒng)，在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和活體動物體內(nèi)的效果。結(jié)果表明，CRISPR/Cas9可在體內(nèi)和體外抑制HBV復(fù)制和表達(dá)，可能是HBV感染一種新的治療策略。

　　在這項(xiàng)研究中，研究人員探討了靶定HBV表面抗原（HBsAg）編碼區(qū)的CRISPR/CRISPR相關(guān)Cas9系統(tǒng)，在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和動物活體內(nèi)的效果。研究人員通過定量酶聯(lián)免疫吸附測定，分析了細(xì)胞培養(yǎng)基和小鼠血清中的HBsAg水平。利用定量PCR和HBsAg表達(dá)，研究人員評估了小鼠肝臟組織中的HBV DNA水平。

　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過CRISPR/Cas9處理后，細(xì)胞培養(yǎng)物和小鼠血清所分泌的HBsAg量降低。免疫組化分析結(jié)果表明，在CRISPR/Cas9-S1+X3處理的小鼠肝臟組織中幾乎沒有HBsAg陽性細(xì)胞。CRISPR/Cas9系統(tǒng)可有效地在HBV DNA中產(chǎn)生突變。因此，CRISPR/Cas9可在體內(nèi)和體外抑制HBV的復(fù)制和表達(dá)，從而可能是HBV感染一種新的治療策略。[詳細(xì)]

　　我國乙肝防控進(jìn)展

　　根據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心的統(tǒng)計(jì)數(shù)字，目前，中國有9000萬乙肝病毒感染者，760萬丙肝病毒攜帶者。近年來，我國乙肝報(bào)告發(fā)病率呈下降趨勢，2014年最新調(diào)查成果顯示，全國1至4歲兒童的乙肝表面抗原流行率降到了0.32%，與2006年相比下降了66%，5至14歲流行率降到了0.94%，下降了61%。

　　在不久前召開的國家衛(wèi)生計(jì)生委例行新聞發(fā)布會中，中國疾病預(yù)防控制中心副主任高福院士表示，全國疾控系統(tǒng)在重大傳染病方面取得了一些突破；其中，為改進(jìn)乙肝疫苗劑量，使5歲以下兒童乙肝表面抗原攜帶率降至1%以下，提前3年達(dá)到WHO西太地區(qū)乙肝防控目標(biāo)；成功研發(fā)60微克乙肝疫苗，將疫苗接種應(yīng)答率由此前的78.6%提高到92.8%。

　　2020年要實(shí)現(xiàn)孕產(chǎn)婦乙肝檢測率達(dá)95％以上

　　6月16日，衛(wèi)計(jì)委在其官網(wǎng)上發(fā)布了《預(yù)防艾滋病、梅毒和乙肝母嬰傳播工作實(shí)施方案（2015年版）》?！斗桨浮分赋觯?020年底，要實(shí)現(xiàn)孕產(chǎn)婦乙肝檢測率達(dá)95％以上，孕期檢測率達(dá)90%以上；要實(shí)現(xiàn)乙肝感染孕產(chǎn)婦所生新生兒乙肝免疫球蛋白注射率達(dá)95％以上。

　　今年的世界肝炎日，國家衛(wèi)計(jì)委副主任王國強(qiáng)指出，我國實(shí)施的以預(yù)防接種為主的綜合防控病毒性肝炎策略取得了顯著的效果。從2015年開始，我國采血機(jī)構(gòu)都運(yùn)用新的方法來篩選血源，能夠進(jìn)一步降低通過輸血來傳播乙肝的風(fēng)險。然而，肝炎防控還面臨許多挑戰(zhàn)，需要多措并舉，進(jìn)一步加強(qiáng)病毒性肝炎防控。

　　WHO發(fā)布首份乙肝治療指南，提出五點(diǎn)主要建議

　　除了我國對乙肝防控的重視；今年3月，世衛(wèi)組織發(fā)布了有史以來第一份慢性乙肝治療指導(dǎo)。這項(xiàng)指導(dǎo)文件涵蓋了所有治療內(nèi)容，從確定哪些人需要得到治療，到使用何種藥物以及如何對感染者進(jìn)行長期監(jiān)測。提出的主要建議有以下五點(diǎn)：

　　1.使用幾種簡便、非創(chuàng)傷性檢測法來評估肝臟疾病的分期，以協(xié)助確定哪些人需要得到治療;

　　2.將肝硬化患者的治療列為重點(diǎn)——肝臟疾病的最晚階段;

　　3.使用替諾福韋或者恩替卡韋這兩種安全且高效的藥物，對慢性乙肝實(shí)施治療;

　　4.利用早期發(fā)現(xiàn)肝癌的簡便檢測法開展定期監(jiān)測，以評判所作治療是否有效以及是否需要停止治療。

　　5.還考慮到了一些特定人群的專門需求，比如艾滋病毒合并感染者、兒童和青少年以及孕婦。

　　特別備注：本文部分內(nèi)容整理自生物通網(wǎng)站