抑制AKT/mTOR通路可以增強(qiáng)索拉非尼在甲狀腺癌中的作用

　　分化型甲狀腺癌（DTC）占所有甲狀腺腫瘤的95%左右。放射性碘治療作為其重要治療措施，目前在臨床上應(yīng)用廣泛，但是在發(fā)生轉(zhuǎn)移的情況下，超過半數(shù)的患者會發(fā)展成為放射性碘難治性DTC。索拉非尼是一種多激酶抑制劑，已被批準(zhǔn)用于治療放射性碘難治的進(jìn)展期DTC。然而，此類患者的無進(jìn)展生存期（PFS）仍然較短，且多數(shù)患者最終會出現(xiàn)耐藥。因此，探索新的治療方法就顯得尤為重要。

　　DTC發(fā)生與RAS基因突變相關(guān)：RAS基因突變會激活MAPK通路及PI3K/AKT/mTOR通路，并且在DTC中可能會優(yōu)先激活PI3K/AKT/mTOR通路。這兩種通路激活都會導(dǎo)致甲狀腺癌惡性程度增高，而且會導(dǎo)致患者對抗腫瘤治療耐藥。已有臨床研究證實，AKT磷酸化水平更低的患者對索拉非尼的應(yīng)答率更高，提示索拉非尼治療的預(yù)后與PI3K/AKT/mTOR通路密切相關(guān)。然而，其中的關(guān)系和具體機(jī)制尚不明確。

　　因此，來自浙江省腫瘤醫(yī)院的研究團(tuán)隊通過設(shè)計細(xì)胞實驗對索拉非尼與PI3K/AKT/mTOR通路之間的關(guān)系及可能機(jī)制展開了探索，以期為DTC的治療提供新的思路。

　　實驗設(shè)計

　　選取細(xì)胞系為人甲狀腺癌細(xì)胞系8505C和FTC133，用不同濃度索拉非尼作用不同時間，同時應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)及抑制劑BEZ235（PI3K和mTOR共同的抑制劑）來抑制AKT通路，觀察各組合效果。

　　干擾效率用AKT轉(zhuǎn)錄（mRNA水平，通過qRT-PCR檢測）及蛋白翻譯（磷酸化的AKT、p70s6k，用westernblot檢測）水平來驗證。p70s6k為mTOR重要下游分子。通路中重要分子（AKT、p70s6k或ERK）的磷酸化水平代表通路激活情況，本研究中，磷酸化水平越高代表激活越明顯。

　　用CCK8試劑盒來檢測細(xì)胞增殖情況和存活率，用膜聯(lián)蛋白v（Annexin-V）和碘化丙啶染色，再用流式細(xì)胞儀來檢測細(xì)胞凋亡。

　　實驗結(jié)果

　　1索拉非尼可以有效抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡

　　在8505C和FTC133細(xì)胞系中用不同濃度的索拉非尼作用不同時間，可以發(fā)現(xiàn)，在劑量高于5uM時，索拉非尼可以有效抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖，這種抑制作用呈現(xiàn)出時間及劑量依賴趨勢。同時，隨著索拉非尼劑量增加，作用72小時后8505C和FTC133細(xì)胞的凋亡比例均上升，在10uM時分別高達(dá)22.9%和56.7%。

　　2索拉非尼可以抑制MAPK及AKT/mTOR通路

　　在8505C和FTC133細(xì)胞系中分別用2.5、5和10uM索拉非尼作用24小時，ERK（MAPK通路中重要分子）表達(dá)水平無明顯變化，但是磷酸化的ERK在10uM條件下與對照組相比顯著下降。類似地，用10uM索拉非尼作用24小時，可以顯著抑制AKT和其重要下游分子p70s6k的磷酸化。

　　3抑制AKT通路可以促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡，同時有助于索拉非尼發(fā)揮作用

　　研究者通過siRNA干擾技術(shù)，使得AKT轉(zhuǎn)錄（mRNA水平）顯著下降，磷酸化的AKT和p70s6k表達(dá)水平也顯著下降。如圖中所示，AKT-siRNA2的干擾最為有效。在此基礎(chǔ)上加入索拉非尼，可以更加有效地降低這兩種蛋白的磷酸化水平。

　　此外，通過檢測細(xì)胞存活率及凋亡情況，可以發(fā)現(xiàn)在兩種細(xì)胞系中，抑制AKT通路同時應(yīng)用索拉非尼可以顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞存活率，其效果比單用索拉非尼或單純抑制AKT通路更勝一籌。

　　4索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用BEZ235可以顯著提高抗甲狀腺癌治療效果

　　BEZ235作為一種PI3K和mTOR抑制劑，可以有效抑制AKT通路。并且，實驗結(jié)果證實，BEZ235與索拉非尼合用可以顯著促進(jìn)兩種甲狀腺癌細(xì)胞凋亡，療效顯著高于單用BEZ235和單用索拉非尼。