我國是乙肝高地方性流行區(qū)，2006年乙肝血清學(xué)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國約9300萬人是乙型肝炎病毒攜帶者，慢性乙肝約2千萬~3千萬人。

乙型肝炎如果得不到有效控制進一步發(fā)展將會演變成肝硬化或肝癌，嚴(yán)重威脅患者生命健康。那么乙肝的早期篩查顯得尤為重要，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性就是重中之重。

案例經(jīng)過

“叮鈴”電話鈴響，我接到一個遠(yuǎn)房親戚的電話，他向我述說他的經(jīng)歷和他的困惑，他現(xiàn)在在我工作的醫(yī)院住院，常規(guī)檢查查出乙肝陽性，可他前不久剛剛在老家縣里做過體檢，當(dāng)時驗乙肝還是正常的，他很困惑這是咋回事呢?

我調(diào)出了他的化驗結(jié)果，乙肝五項一三五陽性，乙肝表面抗原HBsAg稀釋后結(jié)果5101.02IU/mL，HBeAg稀釋后結(jié)果1011.5COI（如圖1），并且有當(dāng)時的復(fù)查記錄，復(fù)查前后結(jié)果一致，于是我找到他本人，看了他之前體檢時的報告單，結(jié)果是四五陽性，報告單上標(biāo)注免疫手工法（如圖2）。

關(guān)于免疫手工法我想到的主要是ELISA法，這時我考慮是不是值太高產(chǎn)生鉤狀效應(yīng)影響ELISA法檢測結(jié)果呢？

于是我用ELISA法進行復(fù)測，同時檢測原倍樣品和稀釋40倍樣品，原倍結(jié)果乙肝五項四五陽性，與他體檢時化驗結(jié)果一致，稀釋40倍后結(jié)果一三五陽，證實我的推測。

在這個案例中我們會有兩個疑惑：本來一三陽性為何測成陰性？本來四是陰性為何測成了陽性？

案例分析

首先介紹一下ELISA法：

ELISA法全名酶聯(lián)免疫吸附試驗，是一類常用的免疫酶技術(shù)，ELISA試劑盒從操作方法和反應(yīng)原理上區(qū)分有兩種：一步法和兩步法，由于一步法少了1次洗板及孵育過程，節(jié)省了時間，得到了廣泛應(yīng)用，我們醫(yī)院針對少量體檢人員也使用的是ELISA一步法試劑，由北京萬泰公司生產(chǎn)，正是我上文提到的復(fù)測所使用的試劑。實際工作中發(fā)現(xiàn)ELISA一步法易受鉤狀效應(yīng)影響而出現(xiàn)漏診。

我以HBsAg檢測為例，因為加入血清后少了一步洗板過程，孵育一個小時后直接加入酶標(biāo)記物，所謂的一步半法，那么如果血清中被檢測HBsAg成分極高與試劑中固相包被的抗體結(jié)合完之后，還會存留很多游離HBsAg，當(dāng)加入酶標(biāo)記物后，游離抗原會競爭性與酶標(biāo)記物結(jié)合，形成游離復(fù)合物，洗板后就把酶標(biāo)記物這部分洗掉，加入底物TMB后因為很少或者沒有酶的存在而不能發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致HBsAg不能被檢測出，出現(xiàn)假陰性，這種現(xiàn)象就叫鉤狀效應(yīng)。

HBeAg與HBsAg的情況是相似的，而且加入樣本后直接加入酶標(biāo)記物，所以更容易受鉤狀效應(yīng)影響出現(xiàn)假陰性。

那本來不存在的Anti-HBe又從何而來呢？

ELISA法檢測Anti-HBe用的是競爭抑制酶聯(lián)免疫吸附試驗，包被HBeAg，加入樣本及酶標(biāo)抗體（HBeAb-HRP）進行溫育，酶標(biāo)抗體和樣本中Anti-HBe競爭酶標(biāo)板上的包被抗原，如果樣本中無Anti-HBe，酶標(biāo)抗體與包被抗原結(jié)合形成“包被抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物”，洗板后加入顯色劑TMB，酶與底物反應(yīng)產(chǎn)生顯色反應(yīng)，檢測結(jié)果為陰性，如果有Anti-HBe結(jié)果與之相反。

在檢測Anti-HBe時，如果樣本中HBeAg含量很高，樣本中HBeAg會與包被HBeAg相競爭結(jié)合酶標(biāo)抗體（HBeAb-HRP）形成游離的“HBeAg-酶標(biāo)抗體”復(fù)合物，洗板后游離復(fù)合物被洗掉，加入TMB后，將不發(fā)生顯色反應(yīng)，因為是競爭抑制反應(yīng)，不顯色則為陽性，所以結(jié)果出現(xiàn)假陽性。

隨著醫(yī)學(xué)檢驗的發(fā)展，化學(xué)發(fā)光免疫分析法正在慢慢取代ELISA法，我們醫(yī)院對于門急診及住院患者檢測乙肝五項使用的是深圳邁瑞公司生產(chǎn)的CL2000i，該儀器使用的就是化學(xué)發(fā)光免疫分析法，它將發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，檢測抗原或抗體的方法。

化學(xué)發(fā)光法具有靈敏度高、檢測時間短、測量范圍寬、穩(wěn)定性好等特點，HBsAg測量范圍0.005～250萬IU/mL，可以避免鉤狀效應(yīng)造成的結(jié)果假陰性，從而避免了檢測結(jié)果的漏報。

總結(jié)與體會

受檢測方法局限性，ELISA一步法因鉤狀效應(yīng)造成的假陰性結(jié)果不容易被發(fā)現(xiàn)，從而造成漏報，為了避免誤報、漏報的現(xiàn)象，我們應(yīng)該具體操作過程中嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行，設(shè)計陰陽性對照，同時做好室內(nèi)質(zhì)控，室間質(zhì)評，其實對于該病例的假陰性情況做好以上這些也很難被發(fā)現(xiàn)，所以對于檢測結(jié)果要綜合分析其他項目檢測結(jié)果以及歷史記錄，并且多與臨床溝通，了解檢測結(jié)果是否與患者實際情況相符，以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ髯黠L(fēng)面對每一份標(biāo)本，盡量避免結(jié)果漏報、誤報的現(xiàn)象。

劉冰主任點評：

酶聯(lián)免疫吸附試驗是一種傳統(tǒng)的免疫分析實驗，它具有靈敏度高，特異性好、成本低等特點，臨床上一直被廣泛應(yīng)用，但是該方法干擾因素較多，不僅僅是鉤狀效應(yīng)，檢測前、檢測中，以及檢測后的諸多因素都會導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陰性或假陽性，比如檢測前的標(biāo)本不合格出現(xiàn)溶血、黃疸等。

再比如檢測中沒有嚴(yán)格按照操作說明書操作，隨意調(diào)整溫育或反應(yīng)時間等等，為此要求我們檢驗人員要嚴(yán)格把握檢測前、檢測中以及檢測后的質(zhì)量控制，對于可疑結(jié)果要按要求復(fù)查，并且多與臨床溝通，爭取我們發(fā)出的每一張化驗單都是及時而準(zhǔn)確的。